一、黄嘌呤脱氢酶（XDH）是治疗痛风小核酸药物的热门靶点
痛风（Gout）影响0.6%的世界人口，临床症状包括痛风关节炎、高尿酸血症（hyperuricemia）以及痛风性肾炎等症状。黄嘌呤脱氢酶（xanthine dehydrogenase，XDH）是一种含钼的羟化酶，可催化黄嘌呤产生尿酸（图1），是血清尿酸（sUA）的主要来源。高尿酸血症不仅是痛风的主要原因，也是糖尿病、慢性伤口、心血管疾病、阿尔茨海默病等的病因之一[1]。
然而，目前FDA批准用以降尿酸达到痛风治疗目的药物别嘌呤醇（Allopurinol）、非布司他（Febuxosta）、苯溴马隆（Benzbromarone）和托匹司他（Topiroxostat）等XDH抑制剂却有致命的副作用[2]。例如最常使用的别嘌呤醇虽然价格低廉且有效，但存在肾毒性的风险，且可引起Stevens-Johnson综合征、中毒性表皮坏死松解症、嗜酸性粒细胞增多和药物超敏反应综合征（DRESS）等不良反应[3]；非布司他2019年受到FDA黑框警告，其具有4.3%心血管死亡率；苯溴马隆曾因肝坏死不良反应事件被欧洲退市。故需要开发新型药物如靶向XDH的siRNA小核酸药物，因应临床未满足治疗的需求。
小核酸药物研发领头羊的Alnylam公司，开发的ALN-XDH是一款皮下注射靶向XDH与 N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶联的的siRNA小核酸药物，旨在通过沉默人类肝脏的XDH来治疗痛风，该药在2022年初启动了1/2期临床试验[4]，可惜的是据Alnylam公司2023年2月报导，已停止ALN-XDH治疗痛风的管线。国际制药公司Arrowhead和Horizon公司达成全球合作和许可协议共同开发ARO-XDH（亦称HZN-457）[5]，于2022年12月启动了1期临床试验；上海舶望制药公司（Argo Biopharma）也开发了XDH管线[6]。综上，XDH是治疗痛风小核酸药物的热门靶点，被赋予巨大的期望，通过半年皮下注射一针，以解决部分痛风患者需要终身服药的不便。
二、现有的应用于小核酸药物药效评价的人源化XDH小鼠模型多需要在动物生物安全二级实验室建模
Arrowhead和上海舶望公司在专利中揭露其靶向XDH小核酸药物的小鼠体内药效评价皆使用了XDH-GLuc AAV8小鼠模型[5-6]，AAV8是具有肝脏组织特异性的AAV病毒（Adeno-associated virus）血清型，所建立的是一种肝靶向的瞬转小鼠模型，通过腺相关病毒AAV8包裹GLuc荧光报导基因和人源XDH（hXDH）基因。又由于人源XDH编码基因序列（CDS）长度大于4 kb，已超过AAV病毒包装外源基因的最大容许长度，mRNA还包含5’和3’UTR，则总长度5.7 kb，故需要把XDH切成两段（nt 80-2899和nt 2820-5717）进行AAV8病毒包装[4]。收集细胞液后再通过超高速离心收集纯化和浓缩XDH-GLuc 的AAV8病毒，根据国家卫生健康委员会制定的人间传染的病原微生物目录[7]，AAV感染动物实验应于动物生物安全二级实验室（ABSL-2）操作（表1），然而仅有少数的单位具备ABSL-2资质与设施。
一般是通过尾静脉注射至少1 x 1011 viral particle/只的XDH-GLuc AAV8病毒感染小鼠进行造模，造模后2周，皮下注射3、6、9 mpk剂量的siRNA药物进行小鼠体内药效评价，在给药前、给药后7天和14天收集血液。通过Gaussia luciferase glow assay试剂盒检测GLuc活性，Arrowhead和上海舶望公司的专利皆通过检测报导蛋白GLuc活性的方法[5-6]，间接评价小鼠体内人源XDH mRNA被siRNA药物敲低的程度（表2）。
三、龙传生物构建的一种肝靶向在体可视人源化XDH转基因小鼠模型，基于质粒DNA表达人源XDH，可于SPF实验室构建，不需要于ABSL-2操作
龙传生物为了解决上述XDH-GLuc AAV8小鼠模型对ABSL-2设施生物安全要求的限制，使用能在小鼠肝脏长期表达的质粒载体，表达人源XDH完整CDS和荧光报导基因Luc2。该模型巧妙地结合小鼠尾静脉注射[8]，在低生物安全的SPF实验室建模，使小鼠肝脏组织特异性表达人源XDH蛋白。通过小动物活体成像仪实时监测人源XDH基因的表达情况和通过ELISA检测小鼠血清中的hXDH蛋白表达，到实验终点时通过qPCR检测肝脏内hXDH mRNA、肾脏病理和血尿酸等指标来评估药效。
四、龙传生物构建的一种肝靶向在体可视人源化XDH转基因小鼠模型的数据展示
1. 实时可视性Luc2讯号
龙传生物实时可视性肝脏人源化XDH小鼠模型能表达Firefly Luciferase luc2基因（Luc2）。在造模之初到实验终点全流程，体重为20g的小鼠，每只腹腔注射200 μl 的D-Luciferin溶液，通过小动物活体成像仪侦测Luc2讯号，能实现转基因的实时可视性，以及转基因在小鼠肝脏人源化的程度（图2）。
2. 人源化瞬转XDH小鼠模型的Luc2讯号与hXDH蛋白水平趋势一致
龙传生物以人XDH基因（Genebank ID：NM_000379.4）为参考序列，构建了pLC-Luc2-P2A-hXDH-3xFlag的质粒DNA。使用6-7周龄的免疫健全鼠C57BL/6或BALB/c雌鼠，建立实时可视性肝脏人源化瞬转XDH小鼠模型。造模后第3天（d3）禁食不禁水过夜，d4一早腹腔注射200 μl 的D-Luciferin溶液，以小动物活体成像仪拍摄Luc2讯号（图2），以野生型（B6 WT）作为对照组扣除背景值，依序为9.9x107、1.3x107和1.8x108光强（p/sec/cm2/sr）。拍摄完恢复饮食与活力后，放回笼盒。
人源化瞬转XDH小鼠模型d5傍晚禁食过夜，d6一早眼眶采血保留小鼠活体，分离血清且10倍稀释后，以人源XDH ELISA试剂盒检测蛋白水平，其人源XDH蛋白浓度依序为1688.5 ± 26.77、1034.9 ± 147.68和1554.3 ± 229.97 pg/ml（图3）。其趋势与Luc2讯号一致，故Luc2讯号能反映人源XDH的蛋白水平。
3. 人源化瞬转XDH小鼠模型的血尿酸与肝脏hXDH mRNA水平
人源化瞬转XDH小鼠模型于d13禁食过夜，隔天一早即两周（2W）到实验终点，安乐死小鼠。采小鼠全血分离的血清，以全自动生化检验仪（日立 ，3110）检测血尿酸（UA），野生型（阴性对照组）小鼠UA值为173.30 μm/ml，人源化瞬转XDH小鼠模型UA值依序为240.70、282.10和273.20 μmol/L。美国风湿性关节炎学会定义，人类尿酸值的正常范围是男性149-416 μmol/L，女性是89-375 μmol/L，当男性 ≥ 416 μmol/L 和女性 ≥ 375 μmol/L，可确诊为高尿酸血症，为痛风的风险之一。然而，啮齿类动物因体内有尿酸酶，尿酸水平较人类低，故此人源化瞬转XDH小鼠模型UA值为265.33 ± 21.792 μmol/L高于阴性对照组，仍具有参考意义。
人源化瞬转XDH小鼠模型的肝脏组织匀浆后，称取0.2g的肝匀浆液，以Trizol法提取总RNA，反转录（RT）成1st-cDNA。设计特异性引物，首先以序列为5’-CAAGTTCACCACCCTGTGTGTC-3’的正向引物，其位于人源XDH编码区序列的nt 3936-3957，序列跨越的第35和36个外显子（exon），可特异性地扩增cDNA模版，而避免扩增基因组（genomic）DNA模版；其次以造模质粒的Flag标签为反向引物，序列为5’-GTCCTTATCGTCGTCATCTTTGTAATCC-3’。进行qPCR，鉴定mRNA水平（与鼠源Actin相对定量），模型组依序为504.5 ± 47.41、165.6 ± 20.44和394.4 ± 38.80倍的人源XDH mRNA水平（图4）。
4. 人源化瞬转XDH小鼠模型2周后有近似临床痛风性肾炎的病理特征
阴性对照小鼠2W肾脏HE染色结构清晰，可见皮质区和髓质区，肾小球结构未见异常，肾小管结构清晰，近曲小管上皮细胞可见刷状缘，未见炎症细胞浸润（图5A左）。然而，人源化瞬转XDH模型组小鼠2W肾脏HE染色，可见小鼠肾脏结构清晰，可见皮质区和髓质区，部分肾小球水肿，肾小管结构清晰，近曲小管上皮细胞可见刷状缘，可见局部小灶性炎症细胞浸润，有近似临床痛风性肾炎的病理特征（图5A右）。类似的结果于肾组织Masson染色并做评分，野生型小鼠对照组评为1分，具有轻度损伤（图5B左）；然而，人源化瞬转XDH小鼠模型组评为2分，具有中度损伤（图5B右）。
综上，龙传生物实时可视性肝脏人源化XDH小鼠模型已具有5个的指标：
①小动物活体成像Luc2讯号
②肝脏hXDH mRNA水平
③血清hXDH蛋白水平
④血尿酸>240 μmol/L以及
⑤肾炎病理
在接受甲方委托进行药效评价服务时，能做最优的质控，以及较全面的数据反馈（图6）。
五、龙传生物构建的一种肝靶向在体可视人源化XDH转基因小鼠模型，其指标优于国内可取得的人源化XDH转基因小鼠模型
目前国内可取得且不需要在ABSL-2操作的人源化XDH转基因小鼠模型，包括B-hXDH mice plus小鼠[9]。虽然肝脏RT-qPCR的数据证明该模型皮下注射Alnylam ALN-XDH siRNA药物，给药后7天，其治疗组人源XDH mRNA敲低率约83.4%，可应用于靶向XDH的小鼠体内药效评价模型，但是在通过western blot 检测蛋白水平，却无法证明B-hXDH mice plus纯合子小鼠肝脏较野生型过表达人源XDH蛋白，或许是使用的抗体无法区分人源或鼠源XDH蛋白所致。然而，龙传生物的肝靶向在体可视人源化XDH转基因小鼠模型通过ELISA检测，可证明该转基因小鼠血清蛋白显着较野生型过表达人源XDH蛋白，龙传生物模型的蛋白质水平指标较佳。
另一国内可取得B-hXDH基因敲入纯合子小鼠[10]，虽然在mRNA水平证明较野生型过表达人源XDH mRNA，但是蛋白水平较野生型低无法证明该模型纯合子过表达人源XDH蛋白，官网在该品系介绍中标注了缺乏蛋白指标的风险提示。此外，B-hXDH基因敲入纯合子小鼠，不但没有一般认知的高血尿酸指标，且其sUA低于20 μmol/L[10]，甚至远低于野生型的sUA指标。然而龙传生物的肝靶向在体可视人源化XDH转基因小鼠模型通过自动生化检验仪检测sUA，虽因啮齿类动物体内有内源的尿酸酶，尿酸水平较人类低，但龙传生物瞬转小鼠模型sUA值仍>240 μmol/L指标，因此较佳。
综上，龙传生物的一种肝靶向在体可视人源化XDH转基因小鼠模型，有以下几种优势：
Ø 不但能解决至少有两家小核酸药物公司需要在ABSL-2等级实验室构建XDH-GLuc AAV8小鼠模型的限制[5-6]，提供了一种可在低生物安全级别构建与药效评价的人源化XDH转基因小鼠模型以外；
Ø 龙传生物模型提供了较目前国内可取得的人源化XDH稳转基因模型[10]更好的sUA和蛋白水平指标；
Ø 从经济层面考虑，龙传生物模型不需要通过大量的细胞培养、AAV三质粒共转染、超高速离心、病毒纯化浓缩等手段建模，提供了一种构建过程经济、有效的模型构建方法；
Ø 从药物研发周期考虑，龙传生物模型不需要传统稳转模型[9-10]的配繁、基因型鉴定纯合子、等待到6-8周龄性成熟等时间成本，提供了一种构建过程简单、快速的模型构建方法；
Ø 从贴近临床的角度考虑，龙传生物模型具备近似临床痛风性肾炎的病理特征。
此外，龙传生物模型还具与人源XDH蛋白强度趋势一致的Luc2讯号，通过小动物活体成像仪不需牺牲小鼠取肝脏做qPCR或Western blot，可实现在体实时可视化的监测人源XDH表达程度，减量动物数量更符合实验动物福利原则。
参考文献
[1] Kimura Y, Tsukui D, Kono H. Uric Acid in Inflammation and the Pathogenesis of Atherosclerosis. Int J Mol Sci. 2021;22(22) pii: ijms222212394..
[2] Singh A, Singh K, Sharma A, Kaur K, Chadha R, Singh Bedi PM. Past, present and future of xanthine oxidase inhibitors: design strategies, structural and pharmacological insights, patents and clinical trials. RSC Med Chem. 2023;14(11):2155-2191.
[3] Goga A, Stoffel M. Therapeutic RNA-silencing oligonucleotides in metabolic diseases. Nat Rev Drug Discov. 2022 Jun;21(6):417-439.
[4] 专利US11326166B1，Xanthine dehydrogenase (XDH) iRNA compositions and methods of use thereof，Alnylam公司，2020，已授权。
[5]专利US11549112B1，RNAi agents for inhibiting expression of xanthine dehydrogenase (XDH), pharmaceutical compositions thereof, and methods of use，Arrowhead公司，2022，已授权。
[6] 专利WO2023202686A1，Composition and method for inhibiting xanthine dehydrogenase (XDH)，
上海舶望制药有限公司，2023，已公开未授权。
[7] 人间传染的病原微生物目录，中华人民共和国国家卫生健康委员会，2023，国卫科教发〔2023〕24号。
[8] Liu F, Song Y, Liu D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 1999 Jul;6(7):1258-66.
[9] B6-hXDH mice plus (Strain NO. 112642) of Biocytogen (Nantong, China)，https://www.biomice.com.cn/animal-models/humanized/others/B-hXDH-mice-plus.html
[10] B6-hXDH mice (Strain NO. T054549) of GemPharmatech (Nanjing, China)，https://cn.gempharmatech.com/shop/productDetails/62700。
