继2024年3月15日微信公众号文章“龙传知识学堂-第2期|龙传生物的实时可视人源化XDH转基因小鼠，助力国内蓝海痛风小核酸药物研发”，本篇新增了人源化XDH转基因小鼠应用箭头公司靶向人源XDH小核酸药物的体内药效评价验证数据，是目前国内可取得、较经济、周期短，较推荐用于小核酸药物等药效评价的龙传生物在体可视肝脏人源化XDH转基因小鼠模型。

    痛风（gout）是一种严重且疼痛的关节疾病，多种成因之一是由高尿酸血症及尿酸盐晶体在关节和肌腱中沉积所引起（图1A），主要影响下肢（脚、脚踝和膝盖）关节，痛风影响0.6%的世界人口。肝脏的XDH（黄嘌呤脱氢酶，xanthine dehydrogenase）在嘌呤分解代谢的末端步骤中起重要作用，它们催化最后两个氧化反应，将次黄嘌呤转化为黄嘌呤，将黄嘌呤转化为尿酸（uric acid，图1B）[1]。

    箭头（Arrowhead）与Horizon公司合作开发的靶向人源XDH基因用以治疗痛风的siRNA小核酸药物ARO-XDH（HZN-457），根据箭头公司已授权的专利[2]显示在非人灵长类NHP模型药效最佳的AD09985，靶向人源XDH基因的编码区（CDS）的倒数第4个外显子（图2红色），根据专利委托合成与NAG37靶头-AD09985化学修饰一致的siRNA药物，进行本模型体内药效验证。

    此外，上海舶望制药公司的专利[3]靶向XDH siRNA药物NHP体内药效评价结果，以最长周期给药后78天判断，敲除率最优为AD00364，靶向且跨越了人源XDH基因CDS的第24和25个外显子（图2绿色），但上海舶望靶头无法取得。又因Alnylam公司治疗痛风一款皮下注射靶向XDH的siRNA小核酸药物ALN-XDH[4]，该药在2022年初启动了1/2期临床试验，但据2023年2月报导已终止临床试验，故未选择。

    龙传生物在体可视肝脏人源化XDH转基因小鼠模型包含了完整XDH CDS，不但适用于靶向XDH CDS候选药物的药效评价以外，亦合适使用箭头公司等专利较优的药物作为阳性对照。

    一般而言，启动项目订C57BL/6或BALB/c或客户指定小鼠，适应性喂养一周后造模，造模后3天在体（in vivo）检测Luc2讯号质控，质控合格后皮下给药6 mpk，给药后6天在体检测Luc2讯号，给药后7天到实验终点，收集血清、肝脏和肾脏等样本（图3）。龙传生物在体可视肝脏人源化XDH转基因小鼠自启动项目、造模、给药到实验终点的周期于三周内，所需的候选药物量仅需1 mg，即可做6个重复（n=6），视客户需求可增加小动物活体成像撷取Luc2讯号的时间点，以及样本采集时间的调整。

    龙传生物在体可视肝脏人源化XDH转基因小鼠模型皮下给药箭头公司AD09985药物6 mpk后5天禁食不禁水过夜，隔天一早（6d）施打底物后以，小动物活体成像仪（PE，IVIS Spectrum）侦测Luc2讯号总量值（total Flux），野生型对照组、人源化XDH小鼠模型皮下注射PBS组（简称：模型PBS组）、人源化XDH小鼠模型皮下注射箭头公司靶向XDH siRNA AD09985药物6 mpk组（简称：模型给药组），三组（n=6）平均依序为2.05 x 10⁵、2.87 x 10⁸、1.14 x 10⁷p/s（图4A）。以平均值来看，模型PBS组的Luc2讯号是模型给药组的25倍高，故箭头公司靶向XDH siRNA药物显著抑制本发明模型的Luc2蛋白表达。模型给药组6只，其中的第2只Luc2讯号强烈，较其他5只显示药物敲除效果不佳，存在个体差异，然而仍瑕不掩瑜，龙传生物在体可视肝脏人源化XDH转基因小鼠模型，弥补业内该模型在体可视性的空白。

    龙传生物在体可视肝脏人源化XDH转基因小鼠模型皮下给药箭头公司AD09985药物6 mpk 6d下午恢复小鼠饮食，傍晚再次禁食不禁水过夜，隔天一早d7到实验终点，解剖均质肝脏后取0.2萃取总量RNA，RT-qPCR鉴定肝脏hXDH mRNA水平（与鼠源Actin相对定量），模型PBS组100.0 ± 5.83 %（图4B蓝色），模型给药组的肝脏hXDH/mActin mRNA水平依序为14.0 ± 1.13 %、89.8 ± 5.42 %、24.5 ± 3.30 %、8.6 ± 0.39 %、6.7 ± 0.67 %、10.3 ± 0.62 %（图4B红色），模型给药组平均约25.6%，即箭头公司小核酸药物的敲除率约74.4%，与小动物活体成像Luc2讯号趋势一致。

    龙传生物在体可视肝脏人源化XDH转基因小鼠模型给药箭头公司AD09985药物6 mpk后7天，检测血清中的血尿酸（sUA），以及肾功能相关尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）等3个生化检验值数据。野生型对照组的sUA平均约161.9μmol/L，模型PBS组的sUA平均约243.1μmol/L，经双尾T检验统计分析p=0.0022（**），意指模型PBS组的sUA显著高于野生型对照组（图5A），此指标优于国内可取得的稳转B6-hXDH小鼠模型[5]。模型给药组的sUA平均约193.22μmol/L，与模型PBS组p=0.0130（*）具有显著差异，意指AD09985药物显著抑制模型的sUA痛风重要的指标之一。尿素氮（BUN）值于野生型对照组、模型PBS组、模型给药组，平均值依序为约8.58、9.98和7.86 mmol/L，其中模型PBS组和模型给药组p<0.05（*），AD09985药物显著抑制模型的BUN肾功能生化指标（图5B）。模型PBS组BUN值约9.98 mmol/L，指标亦优于国内可取得的稳转B6-hXDH小鼠模型[5]。肌酐（CREA）肾功能生化指标的值各组虽有趋势，但6只个体差异较大，无统计学上的意义（图5C）。

    综上，以箭头公司的AD09985靶向人源XDH小核酸药物进行龙传生物在体可视肝脏人源化XDH转基因小鼠模型的体内验证，小核酸药物约74.4%敲低小鼠肝脏的XDH mRNA表达、显著抑制痛风指标sUA值和肾功能生化指标BUN值，以及减弱Luc2报告基因讯号，成功地应用箭头公司靶向XDH AD09985小核酸药物进行模型验证。

    具备与临床近似表型的动物疾病模型进行药效评价，是新药研发在临床前阶段的关键，龙传生物在体可视肝脏人源化XDH转基因小鼠模型，克服了现有的人源XDH稳转模型缺乏较高的血尿酸值和在体实时可视性，解决了XDH-GLuc AAV8瞬转小鼠模型得在ABSL-2操作[6]的限制，为应用于靶向人源XDH小核酸药物的药效评价提供了有力的动物模型。

除了本篇模型以外，龙传生物人源化小鼠模型详如表1。

表1、龙传生物的人源化小鼠模型

    龙传生物提供服务的方式主要是小鼠生命周期闭环在杭州动物房，进行造模和药效评价，提供客户报告或组织；其他方式可讨论请洽商务。

参考文献：

[1]https://www.novocib.com/Xanthine_Dehydrogenase_XDH.html

[2]专利US11549112B1，RNAi agents for inhibiting expression of xanthine dehydrogenase (XDH), pharmaceutical compositions thereof, and methods of use，Arrowhead公司，2022。

[3]专利WO2023202686A1，Composition and method for inhibiting xanthine dehydrogenase (XDH)，上海舶望制药有限公司，2023。

[4]专利US11326166B1，Xanthine dehydrogenase (XDH) iRNA compositions and methods of use thereof，Alnylam公司，2020。

[5] B6-hXDH mice (Strain NO. T054549) of GemPharmatech (Nanjing, China)，https://cn.gempharmatech.com/shop/productDetails/62700。

[6]人间传染的病原微生物目录，中华人民共和国国家卫生健康委员会，2023，国卫科教发〔2023〕24号。